内毒素的定义及去除方法（超滤法和荷电微孔滤膜法、石棉及活性炭吸附法、化学降解法、相分离法、离子交换色谱法、亲和色谱法、PHA法）
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内毒素
内毒素（ET），也称为脂多糖（LPS）或脂质A，是在革兰氏阴性细菌（GNB）生长，分裂和死亡期间释放到周围环境中的有毒物质。 内毒素是细胞壁外层的独特结构，尤其是在细胞破裂后，大量的内毒素会释放并分布在空气中的任何地方。 内毒素是一种相对分子质量较高的化合物，其化学结构主要由多糖（PS）和脂质A（脂质A）组成。 脂质A是内毒素的活性中心，主要由葡萄糖胺，磷酸和10-18个碳的长链脂肪酸组成。 多糖可分为O特异性多糖链（O-Antigen）和核心寡糖（Core oligosaccharide）两部分。
02 内毒素的去除方法
内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的固有成分，在生长，分裂，死亡以及细胞壁破碎或溶解的过程中释放。 因此，内毒素存在于各种溶液中以及与水溶液接触的容器壁上。 可以说无处不在。 它是大多数生产原料，生物材料，药物和生物制剂的污染源。 内毒素分子的热稳定性极高，在250°C的干热条件下会分解长达1小时。 内毒素分子对pH变化不敏感。 尽管高浓度的酸和碱或强氧化剂可以使它们失活，但在实际应用中仍存在许多困难，尤其是蛋白质溶液系统中内毒素的去除。 目前，尚无临床有效的内毒素血症治疗方法。 免疫球蛋白（例如抗E5，HA 21A和抗TNF单克隆抗体）主要用于治疗。 由于这些药物价格昂贵并且可能引起过敏反应，因此临床使用受到限制，并且在临床试验治疗中，结果并不像动物模型中那样令人鼓舞，甚至有些药物还显示出有害作用。 由于内毒素具有很强的热原性和稳定性，少量内毒素会引起发烧，血液循环障碍甚至休克死亡，因此有必要将其从生物样品中去除。 有很多去除内毒素的方法。
根据作用方式的不同，可以将其分为以下三类： （1）非选择法，主要是指超滤法，活性炭吸附法和相分离法； （2）色谱法，主要包括离子交换色谱法，凝胶过滤色谱法和疏水色谱法； （3）选择法主要是指亲和吸附法，还包括金属结合吸附法和氢氧化铝吸附法。 超滤法和荷电微孔滤膜法
超滤方法基于分子量的差异，并使用不同的微孔膜去除样品中的内毒素。 它适用于去除水中或小分子溶液中的内毒素。 对于蛋白质和其他生物大分子溶液，在去除内毒素时，目标样品损失更多。 带电微孔膜方法基于内毒素分子在中性条件下具有净负电荷。 因此，选择具有净正电荷的微孔膜，例如聚砜，聚丙烯腈，聚酰胺等，其可以增强内毒素分子的去除效果。
石棉及活性炭吸附法
基于多空间吸附的活性炭吸附方法主要用于去除分子量较大的内毒素。 该方法适用于较简单的水或小分子溶液，以及低疏水性的低分子量蛋白质或肽溶液，去除介质中的毒素，在弱酸性环境中效果更好。 但是，由于活性炭的选择性差，因此容易吸附活性成分，纯化后的溶液中残留的活性炭不易除去，因此目前很少使用。
化学降解法
化学降解法是指用强酸、强碱或强氧化剂，等使内毒素降解以达到去除内毒素的目的，主要用于玻璃、塑料和其它高分子材料器皿上内毒素的去除。这种方法很可能造成目标产物的失活、流失或降解，这对具有生物活性物质的溶液来说，去除污染的内毒素显然是不利的。
相分离法
用于相分离以去除内毒素的主要试剂是苯酚，Triton X-114和Triton X-100。 Triton是一类非离子表面活性剂，有Triton X-114和Triton X-100两种。 在低温下，Triton在水相中的溶解度很高，此时内毒素也将溶解在其中。 但是随着温度的升高，Triton的溶解度逐渐降低。 当温度上升到某个点（通常在25°C以上）时，Triton将与内毒素一起在水相中形成沉淀物，并通过离心除去Triton沉淀物，并除去上清液样品中的内毒素。 使用Triton X-114，已经开发了一种从大量重组蛋白产物中去除内毒素的方法。 根据本文，使用这种相分离方法，内毒素的去除率高于99％，蛋白质的回收率也高于90％，并且有效成分的活性不受影响。 该方法简单，快速，且内毒素去除率高。 但是，该方法的处理能力小，并且在处理过程中温度从低温变化到高温，这对于某些不稳定的蛋白质是极其不利的。 另外，蛋白质溶液中残留的Triton给后续操作带来不便，因此这种方法使用也非常少。 它将与内毒素一起在水相中形成沉淀。
离子交换色谱法
离子交换色谱法基于内毒素的低等电点，在正常条件下具有更多的净负电荷特性。 阴离子交换色谱法用于从目标样品中分离出内毒素，以达到去除内毒素的目的。 此方法不适用于溶液中存在其他带负电荷的物质。 内毒素分子具有异质的化学性质，其性质受溶液环境的影响很大。 它们经常与蛋白质相互作用，导致离子交换色谱法无法完全去除内毒素。 Rishard等。 研究了影响离子交换色谱去除内毒素的各种因素。 通过增加样品缓冲液的电导率和增加溶液的pH值，可以减弱内毒素与蛋白质之间的相互作用，从而改善内毒素。 为了降低蛋白质的损失率，可以将最终蛋白质中的内毒素含量降低到0.5EU / pg，并且在扩大规模之后，蛋白质的回收率仍可以保持在80％以上。
亲和色谱法
亲和色谱法利用物质的生物学特性来实现物质的分离，是一种高效，高度选择性的内毒素去除方法。 亲和吸附方法通常涉及各种亲和吸附剂的生产和使用，这需要找到合适的亲和配体并将其固定到诸如琼脂糖的聚合物基质上以合成亲和介质。 当前用于去除内毒素的亲和配体大致如下：多粘菌素B / E，组胺，组氨酸，精氨酸，壳聚糖，脱氧胆酸，多赖氨酸和多粘菌素B / E。 乙烯亚胺和一些聚阳离子配体等。除上述亲和吸附剂外，还有用于内毒素去除的金属螯合亲和吸附剂。 罗等。 使用金属螯合亲和色谱法去除内毒素以净化人血并获得更好的结果。 由于金属离子泄漏等安全问题，用于去除生物制品和药物制剂中内毒素的方法需要进一步研究。 亲和吸附剂对目标产物中内毒素的吸附具有高度的特异性和选择性。 这种相互作用主要是通过配体分子上带正电荷的基团与内毒素的磷酸基团之间的离子相互作用。 并且由于疏水作用与内毒素的脂质A部分的协同作用，与其他方法相比，可以更有效地去除生物产品中的内毒素。
聚羟基脂肪酸酯（PHA）法
聚羟基脂肪酸酯（PHA）法的内毒素去除率可以达到90％以上，离子强度几乎不影响内毒素的去除率和蛋白质的回收率，但pH值对其有一定的影响。 研究结果表明，基于rh LBP-Pha P-PHB颗粒的内毒素去除系统具有制备简单，无毒，高效的特点，非常适合蛋白质纯化过程中的内毒素去除。
